Editorial Board

국내산 희렴초를 ㈜청명약초에서 건조된 분말의 형태로 2020년 6월에 구입하여 본 연구의 시료로 사용하였다. 건조된 희렴초를 분쇄기(HR1378, Philips, Karner, Slovenia)로 분말화하였다. 분말상태인 시료를 분석 시까지 –70℃ deep freezer (MDFU52V, Sanyo, Osaka, Japan)에 보관하였다.

분쇄된 희렴초 분말을 80% ethanol 및 증류수를 가하여 3회 반복 추출하였다. 이후 얻어진 희렴초 추출액을 whatman filter paper로 여과한 후 여액을 감압ㆍ농축하였다. 농축된 희렴초를 24시간 –70℃ deep freezer(MDFU52V, Sanyo, Osaka, Japan)에 냉동시킨 후 동결건조기(ED 8512, Ilshin, Yangju, Korea)를 이용하여 동결건조하였으며 이후 얻어진 희렴초 추출물은 분석 시까지–70℃에 보관하여 사용하였다.

총 플라보노이드 함량은 Davis법을 변형한 Chae 등의 방법(2002)에 따라 측정하였다. 각 희석된 희렴초 에탄올 추출물 및 증류수 추출액(0.5 mL), diethylene glycol(Sigma, St. Louis, MO, USA)(0.5 mL)를 혼합한 후 1N NaOH (0.01 mL) 용액을 첨가하여 37℃ 에서 1시간 반응 후 흡광도 420 nm에서 측정하였다. Rutin(Sigma, St. Louis, MO, USA)을 표준물질로 이용하여 표준검량곡선을 적용한 후 총 플라보노이드 함량을 산출하였다. 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis의 방법(1912)에 따라 측정하였다. 각 희석된 희렴초 에탄올 추출물 및 증류수 추출액(0.2 mL)과 folin reagent(Sigma, St. Louis, MO, USA)(0.2 mL)을 혼합하여 3분간 실온에서 반응시킨 후, 10% Na₂CO₃용액(0.8 mL)을 넣고 40분간 암소에서 반응시켰다. 그 후 흡광도 760 nm에서 흡광도를 측정하고, tannic acid(Sigma, St. Louis, MO, USA)을 표준물질로 이용하여 표준검량곡선을 적용한 후 총폴리페놀 함량을 산출하였다. 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis의 방법(1912)에 따라 측정하였다.

2,2-diphenyl-1-picryhydrazyl (DPPH) 라디칼 소거능은 Blois의 방법(1958)을 변형하여 사용하였다. 0.2 mM DPPH 용액 (Sigma, St. Louis, MO, USA) 900 μL에 농도별로 희석된 각각의 시료 100 μL을 첨가하여 37℃ heating block에 30분간 반응시킨 후 흡광도 517 nm에서 측정하였다. 시료 농도별 소거능 값으로 표준곡선을 이용하여 IC₅₀값을 산출하였다.

ABTS⁺ 라디칼 소거능은 Re의 방법(1999)을 변형하여 다음과 같이 측정하였다. 2,2-azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sul fonic acid(ABTS) (Sigma, St. Louis, MO, USA) 7 mM과 potassium persulfate 2.4 mM을 1 : 1 비율로 혼합하여 암소에서 약 24시간 반응시켰다. 이후 실험 직전에 ABTS 시약을 734 nm에서 흡광도가 0.70 ± 0.02가 되도록 methanol로 희석하여 사용하였다. 900 μL ABTS 시약과 100 μL의 농도별로 희석된 각각의 시료를 첨가하여 37℃ heating block에 30분간 반응시킨 후 흡광도 734 nm에서 측정하였다. 시료 농도별 소거능 값으로 표준곡선을 이용하여 IC₅₀값으로 산출하였다.

FRAP assay는 Benzie&Strain(1996)의 방법을 변형하여 다음과 같이 측정하였다. 300 mM sodium acetate buffer(pH 3.6)(Sigma-Aldrich, Louis, MO, USA), 10 mM 2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine(TPTZ) (Sigma-Aldrich, Louis, MO, USA), 20 mM ferric chloride(Sigma-Aldrich, Louis, MO, USA)를 각각 10:1:1의 비율로 혼합하여 FRAP reagent를 만든 후 사용하였다. 10 μL 시료, 90 μL 증류수, 200 μL FRAP reagent를 혼합하여 37℃에서 30분 동안 반응시킨 후 593 nm 흡광도에서 측정하였다. Iron sulfate hexahydrate(Sigma-Aldrich, Louis, MO, USA)를 표준물질로 하여 표준검량곡선을 적용해 추출물 1 mg에 들어있는 iron sulfate hexahydrate의 μM 함량으로 나타내었다.

희렴초의 환원력을 알아보기 위한 reducing power 측정은 Oyaizu(1986)의 방법을 변형하여 다음과 같이 측정하였다. 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2 mg/mL 농도별로 희석한 희렴초 에탄올 추출물과 증류수 추출물 200 μL에 0.2 M phosphate buffer(pH 6.6) 200 μL와 1% potassium ferricyanide 200 μL를 첨가한 후 50℃에서 20분 동안 반응시켰다. 이후 10% trichloroacetic acid(w/v) 200 μL를 첨가한 후 14,000 rpm에서 5분 동안 원심분리 하였다. 원심분리한 상층액 750 μL에 증류수 750 μL, 0.1% ferric chloride 용액 100 μL를 혼합하여 실온에서 10분 동안 방치시킨 후 700 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 시료의 환원력은 흡광도 값으로 나타내었다.

인체유방암세포주 MCF-7과 인체자궁암세포주 HeLa는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)으로부터 분양받아 본 실험실에서 배양하여 사용하였다. MCF-7과 HeLa 세포는 1% penicillin/streptomycin과 10% fetal bovine serum(FBS)을 포함한 RPMI 1640 배지(Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA)를 사용하여 37℃, 5% CO₂ incubator (MCO-18AIC, Sanyo, Osaka, Japan)에서 배양하였다.

MCF-7과 HeLa 세포를 96 well plate에 2×10³/well로 분주하여 24시간 배양하였다. 96 well plate에 0.025, 0.05, 0.1, 0.2 mg/mL의 농도로 희석한 희렴초 추출물 100 μL를 첨가하여 24시간 처리한 후, CellTiter 96 ® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(MTS) 용액(Promega, CA, USA)을 이용하여 각 well에 20 μL씩 첨가하고 37℃, 5% CO₂ incubator에서 반응시킨 후, UV-spectrophotometer(Bio-rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

희렴초 에탄올 추출물을 24시간 처리한 MCF-7과 HeLa 세포를 RNeasy mini kit(QIAGEN, Maryland, USA)를 사용하여 RNA를 추출하고 정량하였다. 동량의 RNA(1 μg)를 PCR RT PreMix (BIONEER, Daejeon, Korea)로 cDNA를 합성하고 MMP-2와 MMP-9 primer를 사용하여 PCR 방법으로 증폭하였고, internal control gene으로 β-actin을 사용하였다(Table 1). 증폭된 PCR 산물들은 1.5% agarose gel을 사용하여 전기영동하여 분리시킨 후 ethidium bromide 용액에서 30분간 반응시키고 UV(Davinch-Chemi imager(TM, ACS-400SM, Davinch-K, Seoul, Korea)를 이용하여 mRNA 발현 정도를 관찰하였다.

본 연구의 모든 실험은 독립적으로 3회 반복을 통해 얻었으며, 각 실험군 간의 유의성 검증은 GraphPad Prism 6 program(GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA)을 이용하여 평균 (mean)과 표준편차 (SD)로 제시하였다. 각 시료간의 통계적 유의성은 p<0.05 수준에서 Student’s t-test와 분산분석(one-way ANOVA)법을 실시하여 유의적 차이를 검증하였다.

본 연구에 사용된 희렴초 에탄올 추출과 증류수 추출물의 추출수율은 각각 18.1%와 14.1%로 나타났다. 여러 식물에 존재하는 플라보노이드류는 대표적인 항산화성 물질이며, 지질 과산화물 및 반응성 산소종의 생성을 억제하는 등 다양한 생리활성을 나타내는 것으로 알려져 있다(Heim et al. 2002). 희렴초 에탄올 추출물과 증류수 추출물의 총 플라보노이드 함량은 각각 120.86 mg RE/g과 61.35 mg RE/g으로 두 군간의 유의적인 차이를 나타내었다(p<0.05)(Table 2). 폴리페놀류는 하나 이상의 벤젠링과 한 개 이상의 수산기를 구성하며, 식이 내 폴리페놀은 항산화 및 항염증 작용 등을 하는 것으로 알려져 있다(Bors et al. 2002). 희렴초 에탄올 추출물과 증류수 추출물의 총 폴리페놀 함량은 각각 182.92 mg TAE/g과 160.39 mg TAE/g로 두 군간의 유의적인 차이를 나타냈다(p<0.05)(Table 1). Lee(2018)의 연구에 의하면 국화과에 속하는 한련초의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량은 각각 274.80 mg/g과 122.75 mg/g으로 나타나 본 연구와 다소 차이를 보였다. 또한 ethanol로 추출한 개똥쑥 잎의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량은 각각 99.98 mg/g과 51.86 mg/g으로 나타내어 본 연구와의 차이를 나타내었다(Ryu et al. 2011).

DPPH를 이용한 전자공여능 측정은 산화환원반응으로부터 전자의 활동을 조사할수 있는 방법으로 널리 이용되고 있다(Hu et al. 2004). 희렴초 에탄올 추출물과 증류수 추출물을 이용한 DPPH 라디칼 소거능을 측정한 결과는 Table 3에 나타냈다. 희렴초 에탄올 추출물을 이용한 DPPH 라디칼 소거능은 0.125 mg/mL, 0.25 mg/mL, 0.5 mg/mL, 1 mg/mL 농도에서 25.02%, 31.11%, 42.56%, 86.96%를 나타내었으며, 라디칼 소거능의 50% 저해능 값인 IC₅₀을 구한 결과, 희렴초 에탄올 추출물은 0.53 mg/mL를 나타냈다. 희렴초 증류수 추출물을 이용한 DPPH 라디칼 소거능은 0.125 mg/mL, 0.25 mg/mL, 0.5 mg/mL, 1 mg/mL 농도에서 12.57%, 16.16%, 31.21%, 61.56%를 나타내었으며, 50%의 라디칼 소거능의 값인 IC₅₀을 구한 결과, 희렴초 증류수 추출물은 0.81 mg/mL를 나타나 희렴초 에탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거능이 희렴초 증류수 추출물에 비해 뛰어남을 확인하였다. Ryu et al.(2011)의 연구에 의하면 국화과에 속하는 개똥쑥 잎의 에탄올 추출물을 DPPH IC₅₀ 값을 측정한 결과, 0.15 mg/mL로 본 논문과 다소 큰 차이를 보였다.

ABTS 양이온 소거능은 ABTS 용액과 potassium persulfate의 반응에 의해 생성된 ABTS 양이온이 추출물의 항산화력에 의해 제거되는 것을 이용한 측정 방법이다. 본 연구 결과, 희렴초 에탄올 추출물을 이용한 ABTS⁺ 라디칼 소거능은 0.125 mg/mL, 0.25 mg/mL, 0.5 mg/mL 농도에서 각각 36.37%, 65.60%, 94.74% 를 나타내었으며, 50%의 라디칼 소거능의 값인 IC₅₀은 0.22 mg/mL를 나타냈다(Table 4). 희렴초 증류수 추출물을 이용한 ABTS⁺ 라디칼 소거능은 0.125 mg/mL, 0.25 mg/mL, 0.5 mg/mL 농도에서 26.80%, 49.30%, 86.04% 를 나타내었으며, 50%의 라디칼 소거능의 값인 IC₅₀을 구한 결과, 희렴초 증류수 추출물은 0.27 mg/mL를 나타냈다. 따라서 희렴초 에탄올 추출물은 희렴초 증류수 추출물에 비해 ABTS⁺ 라디칼 소거능이 우수함을 확인하였다.

환원력은 시료가 Fe³⁺에 수소를 공여하여 라디칼을 안정화시킴으로써 Fe²⁺로 환원되는 것을 이용한 방법으로 널리 이용된다(Hwang & Thi 2014). 희렴초 에탄올 추출물과 증류수 추출물의 reducing power 측정 결과는 Table 5와 같다. 희렴초 에탄올의 추출물을 이용한 환원력은 0.125 mg/mL, 0.25 mg/mL, 0.5 mg/mL, 1 mg/mL, 2 mg/mL 농도에서 각각 0.05, 0.21, 0.37, 0.87, 1.34 나타났다. 희렴초 증류수 추출물의 환원력은 0.125 mg/mL, 0.25 mg/mL, 0.5 mg/mL, 1 mg/mL, 2 mg/ mL 농도에서 각각 0.051, 0.053, 0.06, 0.13, 0.63 나타났다. 희렴초 에탄올 추출물의 환원력은 농도 의존적으로 증가함을 확인하였으며, 희렴초 에탄올 추출물이 증류수 추출물에 비해 환원력이 뛰어난 것을 확인하였다.

FRAP은 항산화물질에 의해 ferric 2,4,6-tripyridyl-striazine[Fe(III)-TPIZ]를 ferrous 2,4,6-tripyridyls-triazine[Fe(II)-TPIZ] 혼합물로 환원되는 원리로 고안된 방법으로 항산화 측정에 널리 이용되고 있다(Benzie & Strain 1996). 희렴초 에탄올 추출물과 증류수추출물의 FRAP 활성은 Table 6과 같다. 희렴초 에탄올 추출물 1.0 mg/mL 농도에서 FRAP 활성을 측정한 결과, 희렴초 에탄올 추출물은 50.36 μM, 희렴초 증류수 추출물은 35.77 μM으로 희렴초 에탄올 추출물의 FRAP 활성이 유의적으로 더 높음을 알 수 있었다 (p<0.05). Ryu et al.(2011)의 연구에 따르면 에탄올로 추출한 개똥쑥 잎의 FRAP 활성은 133.58 μM, 물로 추출한 개똥쑥 잎의 FRAP 활성은 54.53 μM로 나타나 본 연구와 차이를 나타내었다.

희렴초 추출물이 인체 유방암세포인 MCF-7과 자궁암 세포주인 HeLa의 성장에 미치는 영향을 MTS assay를 통해 측정하였으며 그 결과는 Fig. 1과 2에 나타내었다. MCF-7 세포주에 희렴초 에탄올 및 증류수 추출물을 각각 0.025g/mL, 0.05 mg/mL, 0.1 mg/mL 및 0.2 mg/mL 처리하여 24 시간 동안 배양한 결과, 무처리군에 비해 0.1 mg/mL와 0.2 mg/mL 희렴초 에탄올을 첨가한 세포주의 성장이 유의적으로 억제되는 효과를 나타내었다 (p<0.05). 위와 동일한 조건으로 희렴초 추출물이 HeLa 세포의 성장에 미치는 영향을 확인한 결과, 0.2 mg/mL 희렴초 에탄올을 첨가한 세포주의 성장이 무첨가군에 비해 유의적으로 억제되었다 (p<0.05). 그러나 희렴초 증류수 추출물을 처리한 경우, MCF-7과 HeLa 세포에서 암 성장 억제 효과를 나타내지 못함을 확인하였다.

Fig. 1. 
Effects of Siegesbeckia glabrescens Makino extract on the proliferation of MCF-7 cells for 24 h by MTS assay.

The data are reported as the mean ± SD of triplicate experiments (n=3). Statistically significant (p<0.05) compared to the *corresponding DMSO-treated control by one-way ANOVA.

Fig. 2. 
Effects of Siegesbeckia glabrescens Makino extract on the proliferation of HeLa cells for 24 h by MTS assay.

The data are reported as the mean ± SD of triplicate experiments (n=3). Statistically significant (p<0.05) compared to the *corresponding DMSO-treated control by one-way ANOVA.

암세포의 성장 및 전이는 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)의 분해와 신생혈관의 형성(angiogenesis) 후 종양세포의 순환계를 통한 이동, 타 조직에 부착하여 침윤하는 과정을 통해 발생한다(Kato et al. 2002). Matrix metalloproteinase(MMPs)는 세포외 기질의 재형성 및 분해를 통해 암의 전이 및 혈관 질환과 같은 다양한 생리적 과정과 연관되어 있다(Amar & Fields 2015). MMPs 중 MMP-2와 MMP-9의 발현이 세포외기질의 주요 구조 성분인 type IV collagen을 분해하여, 암세포의 침윤 및 전이와 연관된 것으로 보고되어 있다(Shay et al. 2015). 본 연구에서는 희렴초 추출물이 암세포 전이와 관련된 인자인 MMP-2와 MMP-9의 mRNA 발현에 미치는 영향을 알아보았다(Fig. 3). 희렴초 증류수 추출물이 두 종류의 암세포 증식에 아무런 영향을 미치지 못하였으므로, 희렴초 에탄올 추출물만을 이용하여 MCF-7과 HeLa 세포에서 MMP-2와 MMP-9의 mRNA 발현 양상을 측정하였다. 그 결과, MCF-7 세포주에 0.2 mg/mL 희렴초 에탄올 추출물 처리 시 MMP-2 mRNA 발현이 유의적으로 감소함을 나타내었으며(p<0.05), HeLa 세포에서는 차이를 보이지 않았다. 또한 희렴초 에탄올 추출물 (0.2 mg/mL)의 농도로 처리하였을 경우 MCF-7과 HeLa 세포주에서 MMP-9 mRNA 발현이 유의적으로 감소함을 나타내었다(p<0.05).

Fig. 3. 
Effect of Siegesbeckia glabrescens Makino 80% EtOH extract on MMP mRNA expression in MCF-7 and HeLa cells.

The data are reported as the mean ± SD of triplicate experiments (n=3). Statistically significant (p<0.05) compared with the *corresponding DMSO-treated control by one-way ANOVA.